第二天?周六?上午?9:00-12:00

內(nèi)容

1, px330質(zhì)粒系統(tǒng)介紹。

2，sgRNA oligos模板退火方案。

3，退火gRNA與線性化CRISPR/Cas9載體連接詳細(xì)方案。

4，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（DH5α）。

5，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板培養(yǎng)。

6，鑒定插入oligo后的基因編輯質(zhì)粒ps330質(zhì)粒體系。

7，構(gòu)建同時(shí)敲除兩個基因的質(zhì)粒體系。

8，如何構(gòu)建CRISPR/Cpf1質(zhì)粒體系。

9，CRISPR/Cpf1質(zhì)粒體系鑒定。

第二天周六下午?13:00-18:00

1，Cas9的多功能系統(tǒng)（如Cut, Nick, Activate, dCas9-FokI）的詳細(xì)介紹。

2，利用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因修飾小鼠方法介紹和實(shí)際操作方案

3，CRISPR/Cas9相關(guān)基因修飾小鼠模型介紹和操作方案

4，利用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因修飾大動物（豬、猴）方法介紹和實(shí)際操作方案

5，CRISPR/Cas9與基因修飾大動物模型介紹和詳細(xì)操作方案

專題：利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯動物細(xì)胞系

1，?CRISPR/Cas9質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法

2，?陽性細(xì)胞克隆篩選

3，?基因編輯細(xì)胞系的建立

4，?基因修飾情況分析方法

第三天?周日??上午9:00-12:00

1，?CRISPR/Cas9重組子細(xì)菌克隆挑取，擴(kuò)大化培養(yǎng)，鑒定，

2，?基因修飾基因組DNA模板（轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9到動物細(xì)胞后提取DNA）制備

3，?目的靶基因的基因組DNA片段的PCR擴(kuò)增，電泳檢測PCR產(chǎn)物

4，?PCR產(chǎn)物退火變性，T7E1酶切，電泳鑒定基因修飾情況

專題：利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因敲除或敲入小鼠

1，基因編輯工具CRISPR/Cas9基本背景介紹

2，sgRNA設(shè)計(jì)及其功能驗(yàn)證

3，小鼠受精卵分離和培養(yǎng)

4，CRISPR/Cas9系統(tǒng)顯微注射到小鼠受精卵

5，受精卵顯微注射后回輸?shù)酱心甘篌w內(nèi)

6，PCR和T7E1分析和鑒定基因敲除小鼠（Founder）

7，基因敲除小鼠基因敲除情況分析

8，CRISPR/Cas9構(gòu)建基因敲除小鼠詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程歸納和總結(jié)

第三天?周日?下午13:00-15:00

專題：實(shí)驗(yàn)結(jié)果的點(diǎn)評與討論

1，?CRISPR/Cas9載體構(gòu)建討論

2，?目的靶基因的基因組DNA片段的PCR擴(kuò)增，電泳檢測PCR產(chǎn)物結(jié)果討論

3，?PCR產(chǎn)物T7E1酶切，電泳鑒定基因修飾情況結(jié)果討論

4，?Sanger測序鑒定基因編輯結(jié)果

1）?CRISPR/Cas9質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化子測序結(jié)果確認(rèn)

2）?Sanger測序閱讀基因編輯情況

3）?如何從測序色譜圖中閱讀靶向突變等位基因型

專題：利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因修飾大型動物（豬）

1，?利用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因修飾大型動物（豬）流程

2，?基因修飾大型動物優(yōu)勢

3，?利用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因修飾大動物（豬）模型介紹

專題：CRISPR/Cas9脫靶問題分析

1，?脫靶產(chǎn)生的原因

2，?脫靶檢測方法

3，?降低脫靶問題的方法

專題：基因編輯工具拓展

1，?CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

2，?新基因編輯工具Cpf1，C2C2的用法與比較

3，?基因編輯工具的倫理問題

4，?基因編輯工具的應(yīng)用拓展。

5，?根據(jù)學(xué)員的研究內(nèi)容，詳細(xì)答疑如何使用基因編輯工具。

第七期上海CRISPR/Cas9基因編輯學(xué)習(xí)班時(shí)間，地點(diǎn)